生物發酵工程是指利用微生物或細胞的特定功能結合現代工程技術,為人類生產特定目標產品的一種新技術。生物發酵技術與日常生活緊密相關,比如我們常見的酒精和面包就是生物發酵的產物。隨著生物技術的快速發展,現代生物發酵技術越來越多的應用于生物醫藥行業,比如在胰島素、干擾素、疫苗多種生物醫藥產品生產中起著關鍵作用。根據發酵條件不同,生物發酵可分為好氧發酵和厭氧發酵。好氧發酵主要分為液體表面培養發酵、多孔或顆粒固體培養基表面上發酵和通氧深層發酵幾種方法。厭氧發酵采用不通氧的深層發酵。生物發酵根據其操作方式和工藝流程也可以分為分批式發酵、流加式發酵、半連續發酵、灌流式發酵和連續發酵等幾種方法。生物發酵是指用來進行生物發酵的容器在生物發酵工藝中,生物發酵罐作為關鍵設備,控制生物發酵中關鍵參數,確保生物發酵可以得到優質、高產、低耗的產品。
生物發酵過程中pH值對發酵目標物的生產起著至關重要的作用。各種微生物生長都需要合適pH值。超過適宜的pH值范圍,微生物的生長會受到抑制甚至死亡,導致生物發酵失敗。同時,在不同pH條件下,發酵過程中酶的活性也會不同,影響微生物生物代謝的速率。有些微生物在不同pH條件下,代謝產物種類和質量也不一樣。所以對于生物發酵過程中pH值的有效測量和實時監控是十分重要的。
生物發酵罐一般都配有pH探頭,實時監測發酵液的pH值。由于生物發酵罐在發酵前后都要進行高溫蒸汽滅菌,而常用的生物發酵溫度通常只有(25~35)℃,所以選用的pH電極在常溫范圍需要有較高的靈敏度,同時需要可以耐受至少125℃,30min的滅菌溫度要求。通常生物發酵罐使用耐受溫度的原位pH電極。為了確保pH電極測量的準確性,在使用過程中需要定期對使用的pH電極進行校準和維護。校準可以使用市面上購買的pH標準物質,注意校準時需要將溫度調整至標稱溫度(通常為25℃)。日常使用過程中,應定期對pH探頭進行清洗,并且添加電極緩沖液(通常為(3~5)mol/L的氯化鉀溶液)。
微生物在其最適的溫度范圍內,生長速度會隨著溫度升高而增加,所以在最適溫度范圍內,發酵溫度越高,生長周期就會縮短。但是溫度過高反而會抑制微生物的生長。許多產物的行程速度對于溫度也有一定的要求,比如金色鏈絲菌在低于30℃時,合成金霉素的能力較強,然而在大于35℃的條件下,金霉素的合成停止,轉而合成四環素。所以對于生物發酵過程中溫度控制及發酵結果樣品產率有著至關重要的影響。
生物發酵過程中,溫度控制主要從菌種的生長階段及生產情況進行選擇。在培養過程中,微生物會分解氧化培養基中的營養物質,散發一部分熱量造成體系溫度升高。同時,機械攪拌也會造成熱量增加,所以罐體需要根據溫度探頭的測量值進行溫度控制。而大部分生物發酵罐都帶有原位滅菌功能,因此在滅菌過程中溫度控制也十分重要。如果滅菌溫度達不到預設溫度,就會直接導致生物發酵過程污染,從而導致生物發酵失敗。
生物發酵罐的溫度探頭一般選擇PT100探頭,探頭長度根據罐體大小有所區別。溫度探頭穩定性相較于pH探頭更加穩定,但是也需要定期進行校準和標定,保證溫度探頭準確。
大部分微生物和細胞的生長都需要適宜的氧氣濃度,所以溶氧是需氧發酵控制中最重要的參數之一。培養液中溶氧的多少會對發酵產物的形成及產量產生不同影響。同時對于溶氧的實時監控可以有效控制生物發酵的實時狀態。生物發酵過程中溶氧值異常偏高,說明培養基中含有的目標菌體較少,已經死亡,培養基中的氧氣無法得到有效利用,需及時查找原因。發酵過程中溶氧異常偏低,一般說明培養基可能受到污染,導致雜菌生長,消耗了大量的氧氣。
溶解氧電極需要經常進行維護。在儲存一段時間之后,建議使用前和使用一段時間后更換電解液,且在使用前須通電極化。溶氧電極在使用前都要進行標定,通常生物發酵的溶氧探頭都是采用百分比顯示模式。通過對0%和100%的情況進行標定。校準介質可以是空氣或者飽和介質。如果是在空氣中進行校準,需要將探頭擦干,待讀數穩定后開始校準;如果使用飽和介質為校準介質,一般是將發酵罐攪拌開至最大,同時通氣大量飽和空氣一定時間后進行校準。0%的數值點可以配置容解氧零氧標定溶液進行校準。
生物發酵過程中需要不停的攪拌,使罐內各個區域達到氣液分散、固液懸浮、混勻、傳熱等要求。一般的生物發酵過程包括氣液固三相,即空氣、CO2等氣體產物、液態培養基和生物細胞及載體顆粒。氣液固三相通過攪拌裝置進行混勻,達到穩態。生物發酵的攪拌過程需要注意:大多數生物顆粒對剪切力較為敏感,剪切作用可能影響細胞的生成速率和組成比例。所以如果攪拌速度過快會直接破壞生物細胞,無法得到預期的發酵效果;攪拌速度過慢又會導致混勻不充分,可能會造成部分微生物缺氧,影響發酵效率。
生物發酵罐通常采用機械式攪拌的模式,在發酵罐的頂部通常設有攪拌電機,通過帶動攪拌軸達到對生物發酵罐中攪拌混勻的作用。生物發酵罐的攪拌轉速可以直接通過光電轉速表進行測量和質量控制。部分發酵罐只給出了電機的功率值,需要定期進行測量,以保證攪伴轉速的穩定。
生物發酵過程的流量控制也十分關鍵。生物發酵罐通常通過各種流量計調控反應中的補料、通氣、排氣、調節pH等多項參數。生物發酵過程中需要控制的流量主要包括液體流量和氣體流量兩種。氣體流量主要是控制生物發酵中必要的氣體,如空氣、CO2等,一般與溶氧測量和壓力測量相關聯。而控制生物發酵罐中的液體流量,主要是控制各種物質補料速度,從而達到對培養基各種理化性能的調控。同時,液體流量還要控制夾套水流量,用來控制發酵罐的溫度。
生物發酵過程中的液體流量一般是通過液體流量計進行控制。根據發酵罐體的大小,液體流量計的量程不同。流量計可以拆卸進行送檢質量控制,或是通過串聯標準液體流量計進行校準。氣體流量控制通常使用浮子流量計、質量流量計等,也可以通過拆卸的方式定期進行計量溯源。
培養基的滅菌和發酵過程都需要檢測壓力的變化,罐壓的保持是為了防止外界空氣進入造成雜菌污染。因此,必須使發酵系統壓力保持高于外界大氣壓,同時罐壓可以直接影響二氧化碳和氧氣的溶解度。但是過高的壓力會影響微生物DNA復制,降低生產率。
生物發酵罐壓力測量一般是通過壓力表測量罐體內壓力,可以直接對壓力表進行檢定,確保罐內的壓力準確,或者通過無線壓力傳感器在罐體內實時測量罐內壓力。
除了上文總結的生物發酵常用關鍵控制參數以外,生物發酵罐還有其他參數需要控制。如消泡電極控制、尾氣檢測、稱重檢測等多項參數都對生物發酵的產率有著至關重要的影響。生物發酵過程是一個綜合多學科的生物反應過程,科學地對生物發酵罐的各項參數進行有效地計量檢測和溯源,可以有效保證生物發酵目標物的產率,提高經濟效益。